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Une méthode à haute sensibilité pour l’analyse structurale des GAGs

L’équipe SAGAG a récemment mis en place dans son laboratoire une méthode hautement sensible pour déterminer la composition disaccharidique de GAGs (purifiés à partir de cellules en culture ou de tissus).

Une méthode à haute sensibilité pour l’analyse structurale des GAGs

Equipe RV/HLJ

 

Correspondance :

 

L’équipe SAGAG a récemment mis en place dans son laboratoire une méthode d’analyse disaccharidique des GAGs basée sur un marquage fluorescent post-colonne. Les GAGs à étudier sont dans un premier temps extraits et purifiés (à partir de cellules en culture ou de tissus), puis dépolymérisés en disaccharides par digestion enzymatique exhaustive (chondroïtinase ABC ou héparinases I, II et III). Les produits de dégradation sont ensuite analysés par chromatographie de paires d’ions (ion pairing chromatography), impliquant l’addition dans les tampons de course d’un contre-ion possédant une ou plusieurs chaînes alkyles (dans notre cas, le tetra-N-butylammonium hydrogen sulfate). Ce contre-ion peut ainsi se fixer sur la phase stationnaire hydrophobe de la colonne de phase inverse et retenir les molécules chargées présentes dans la phase mobile. L’élution des molécules retenues se fait par application d’un gradient de NaCl.

La séparation des disaccharides par cette technique est réalisée grâce à un système HPLC complété par l’ajout d’une deuxième série de pompe permettant l’injection du réactif de marquage en sortie de colonne (figure 1). Le réactif utilisé, est le composé fluorogénique 2-cyanoacétamide qui, en conditions alcalines, vient réagir avec l’extrémité réductrice des sucres. Le mélange ainsi formé passe ensuite dans une boucle disposée dans un four réactionnel (4 minutes, 130°C) afin de permettre le marquage, puis dans un détecteur de fluorescence.

 

Figure 1: Schéma du système de RPIP-HPLC avec marquage post-colonne en ligne

 

Contrairement aux techniques de marquage fluorescent traditionnelles, cette méthode ne nécessite pas une séparation préalable des disaccharides du fluorophore libre avant analyse, la colonne n’est jamais en contact avec les réactifs de marquage et le profil d’élution des disaccharides n’est pas altéré. Cette méthode permet une séparation efficace des différents disaccharides (CS/DS et HS/héparine) standards disponibles (figure 2A), avec une sensibilité de détection de l’ordre du nanogramme (Figure 2B). Cette approche permet donc de déterminer la composition des GAGs à partir de très faibles quantité de matériel (~105-106 cellules en culture ou ~20-50mg de tissu).

 

Figure 2 : analyse disaccharidique d'HS par RPIP-HPLC: (A) Détection et séparation des 8 standards disaccharidiques commerciaux d'HS. (B) Limite de sensibilité de la technique (injection de 2ng du disaccharide Ua- GlcNAc)

 

Applications récentes :

Heidari-Hamedani et al., 2015 Cell Signal. 27:2054-67

 

Plus d’information sur la technique :

Ledin et al., 2004. J Biol Chem. 279:42732-41.

Staatz et al., 2001. Methods Mol Biol. 171:41-52.